文章來(lái)源：醫(yī)藥魔方Med

作者：樹葉

治療耐藥性永遠(yuǎn)是一個(gè)熱門的討論話題，無(wú)論小分子、大分子亦或先進(jìn)的PROTAC、ADC，似乎都無(wú)法逾越耐藥的鴻溝?？贵w偶聯(lián)藥物（antibody drug conjugate，ADC）作為時(shí)下的熱門賽道，又存在那些耐藥機(jī)制呢？旨在更清晰的理解耐藥機(jī)制，本文以HER2 ADC 為例，進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹。

ADC的作用機(jī)制：探究耐藥的溯源

創(chuàng)新性的HER2 ADC全球已經(jīng)上市了3款藥物，分別為恩美曲妥珠單抗（T-DM1）、Enhertu(T-DXd)和維迪西妥單抗（RC48-ADC）。ADC通常都有3個(gè)核心成分：能與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合的抗體（antibody）、細(xì)胞毒性載荷（payload）和將兩者連接在一起的連接子（linker）。對(duì)于HER2 ADC而言，通?？贵w多是采用曲妥珠單抗或帕妥珠單抗及其相關(guān)類似物，但也有使用其他的抗體或雙抗；Linker幾乎都是采用了可裂解形式，而載荷也多是細(xì)胞周期性毒素（如下圖）。

Cancers 2022, 14, 154（下同）

通常，ADC藥物作用機(jī)制主要包括以下步驟：ADC藥物中的抗體與細(xì)胞表面表達(dá)的抗原HER2結(jié)合，此后ADC-HER2形成的復(fù)合物通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞或胞飲作用被內(nèi)化，在成熟的溶酶體作用下ADC發(fā)生降解，釋放的細(xì)胞毒性物質(zhì)導(dǎo)致DNA損傷等作用，最終影響腫瘤細(xì)胞的增殖。

ADC藥物作用機(jī)制圖示

然而，具體的藥物在作用機(jī)制上也會(huì)基于藥物的性質(zhì)存在差異。以T-Dxd和T-DM1為例，首先兩個(gè)藥物在Linker的選擇上存在差異，所以使用不可裂解的T-DM1切割只能發(fā)生在溶酶體區(qū)室，需要酸性蛋白酶（如組織蛋白酶B或纖溶酶）的作用，才能釋放細(xì)胞毒DM1；而可裂解的T-Dxd則可發(fā)生在早期或晚期內(nèi)體以及溶酶體中。其次，雖然兩個(gè)藥物都是作用于細(xì)胞周期，但T-DM1作用于靶細(xì)胞中的微管聚合屬于微管蛋白抑制劑，而T-Dxd作用于拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 阻止DNA鏈的斷裂和重新連接，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。第三，T-DM1不具備旁觀者效應(yīng)，而T-Dxd可以通過(guò)旁觀者效應(yīng)殺傷HER2低表達(dá)或不表達(dá)腫瘤細(xì)胞。

不難看出，盡管HER2 ADC在作用機(jī)制上具有相似性和一致性，但也并未完全相同。表現(xiàn)在抗體種類、Linker和載荷上的差異形成了藥品間的差異化策略，多數(shù)也會(huì)轉(zhuǎn)化為臨床療效的不同。

ADC的耐藥機(jī)制：基于作用機(jī)制的追溯

在理解了ADC藥物的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制之后，就不難推測(cè)可以發(fā)生的耐藥種類：抗原HER2的改變、HER2內(nèi)化的改變、溶酶體的改變、藥物外排泵的表達(dá)和活性增加、增加配體的產(chǎn)生和替代通路的激活、信號(hào)通路蛋白變化等。

1. HER2的改變

仍以T-DM1為例，由于T-DM1中的抗體需要結(jié)合HER2蛋白，當(dāng)患者接受了前線的曲妥珠單抗和帕妥珠單抗治療之后，可能會(huì)降低HER2的表達(dá)水平，同時(shí)T-DM1又不具備旁觀者效應(yīng)，導(dǎo)致降低了T-DM1 作為二線療法的治療效果。因此，作為應(yīng)對(duì)需要對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌患者重新進(jìn)行 HER2 狀態(tài)檢測(cè)，以保證療效。

對(duì)于在手術(shù)前經(jīng)歷了局部進(jìn)展，也會(huì)顯示出HER2表達(dá)的高度異質(zhì)性?？偟膩?lái)說(shuō)，就是要關(guān)注HER2表達(dá)狀態(tài)，HER2缺失或表達(dá)下降都是T-DM1耐藥的原因。推此即彼，與曲妥珠單抗結(jié)合的亞域IV改變或缺失以及與帕妥珠結(jié)合的亞域Ⅱ都會(huì)對(duì)使用這兩種抗體制備的ADC藥物產(chǎn)生抗性。此外，MUC4作為一種膜相關(guān)粘蛋白，其表達(dá)也與曲妥珠單抗耐藥有關(guān)，通過(guò)部分掩蔽HER2并阻止其結(jié)合。

2. HER2內(nèi)化的改變

當(dāng)HER2 ADC 與 HER2 結(jié)合之后，該復(fù)合物就會(huì)內(nèi)化到細(xì)胞中，內(nèi)皮素A2蛋白可以促進(jìn)這一過(guò)程。事實(shí)上，已經(jīng)觀察到這種蛋白在HER2陽(yáng)性細(xì)胞中的沉默會(huì)降低HER2內(nèi)化并減弱對(duì)曲妥珠單抗和T-DM1的反應(yīng)。HER2泛素化和運(yùn)輸?shù)饺苊阁w的過(guò)程可以通過(guò)與伴侶HSP90的組成性結(jié)合而改變。因而，改變HER2靶向治療的功效。

另一方面，含HER2的內(nèi)體向質(zhì)膜的快速再循環(huán)可能會(huì)減緩T-DM1到達(dá)溶酶體的速度。HER2的特點(diǎn)是快速循環(huán)，在曲妥珠單抗結(jié)合后觀察到這一過(guò)程。在對(duì)T-DM1獲得性耐藥的臨床前模型中，觀察到 T-DM1-HER2 復(fù)合物的更快循環(huán)和DM1的細(xì)胞內(nèi)釋放減少。不過(guò)，該模型的 HER2 水平也低于親本系，也會(huì)導(dǎo)致表現(xiàn)耐藥表型。

最近，描述了 T-DM1 通過(guò)由 CAV1 組成的小窩內(nèi)化，這種情況限制其到達(dá)溶酶體的抗性機(jī)制。在臨床前模型中，對(duì) T-DM1 具有獲得性抗性的細(xì)胞系中觀察到 CAV1 的過(guò)表達(dá)。此外，T-DM1 和 CAV1 的共定位與一組 HER2陽(yáng)性細(xì)胞中對(duì) T-DM1 的反應(yīng)降低相關(guān)。而且，CAV1 的沉默不足以恢復(fù) T-DM1 敏感性。

3. 溶酶體的改變

HER2 ADC 到達(dá)溶酶體和溶酶體酶的處理對(duì)于釋放與抗體結(jié)合的有效載荷至關(guān)重要。溶酶體是酸性區(qū)室，蛋白水解能力取決于調(diào)節(jié)溶酶體 pH 值的液泡質(zhì)子泵 H+-ATP 酶（V-ATP 酶）。由于帶電的分解代謝物（極性）不能自主滲透溶酶體膜，因此 Lys-MCC-DM1 需要借助從溶酶體到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。SLC46A3 是一種溶酶體膜蛋白，可介導(dǎo) Lys-MCC-DM1 從溶酶體向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，在T-DM1獲得性抗性的幾個(gè)模型中觀察到 SLC46A3 表達(dá)缺失，其慢病毒表達(dá)恢復(fù)了對(duì) T-DM1 的敏感性。此外，最近研究表明，溶酶體 pH 值的增加以及溶酶體酶活性的降低也是對(duì) T-DM1 產(chǎn)生抗性的原因。

另一種對(duì) T-DM1 抗性的模型中，還報(bào)告了溶酶體酸化的降低。在這種情況下，觀察到 Lys-MCC-DM1 的細(xì)胞內(nèi)濃度降低，因?yàn)?V-ATP 酶在抗性細(xì)胞溶酶體中的異?；钚越档土?T-DM1 的分解代謝和活性分解代謝物的產(chǎn)生。

4. 藥物外排泵的表達(dá)和活性增加

外排泵的表達(dá)和/或活性增加是化療耐藥性的重要機(jī)制。這也不難理解，如果細(xì)胞中釋放的有效載荷，過(guò)多的被外排泵轉(zhuǎn)送至胞外，特別是對(duì)Lys-MCC-DM1這種無(wú)法自動(dòng)滲透的藥物（類似旁觀者效應(yīng)），有效性必然降低。

具體而言，ABCB1/MDR1/P-gp、ABCC1/MRP1、ABCC2 和 ABCG2/BCRP/MXR/ABCP 的表達(dá)改變導(dǎo)致臨床前模型中對(duì) T-DM1 的耐藥性。在這些研究中，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的抑制恢復(fù)了對(duì) T-DM1 的敏感性。

5. 配體增加和激活替代通路

其實(shí)，這種機(jī)制更多的是具有了替代信號(hào)通路，以及影響了藥物療效的發(fā)揮。在一項(xiàng)體外研究中，由于HER2/HER3 的二聚化和PI3K/AKT通路的激活，或者在一些 HER2陽(yáng)性細(xì)胞系中添加 HER3 配體神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白 (NRG) 抑制了T-DM1 的作用。

此外，在對(duì) T-DM1 獲得性耐藥和對(duì)曲妥珠單抗原發(fā)性耐藥的模型中，HER2 水平的降低伴隨著EGFR 水平的升高，也是一種耐藥機(jī)制。然而，EGFR 沉默不足以逆轉(zhuǎn)耐藥表型。并且，觀察到增加的 EGFR 水平導(dǎo)致整聯(lián)蛋白（α5β1 和 αVβ3）的量增加，從而導(dǎo)致抗性細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性增強(qiáng)。

6. 參與信號(hào)通路的蛋白質(zhì)的變化

這種耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，而且針對(duì)不同的載荷也會(huì)表現(xiàn)出不同的機(jī)制。不過(guò)，這種耐藥機(jī)制又相似或接近直接使用載荷導(dǎo)致的信號(hào)通路上的改變。

針對(duì)T-DM1而言，處理后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白 B1 增加并停滯在細(xì)胞周期的 G2/M期，這一過(guò)程會(huì)觸發(fā)有絲分裂災(zāi)難表型特征。然而，在T-DM1 具有抗性的細(xì)胞中沒(méi)有觀察到這種現(xiàn)象，沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞周期蛋白 B1 的積累。

此外，也發(fā)現(xiàn)在對(duì) T-DM1 具有抗性的模型中有絲分裂激酶、polo 樣激酶 1 (PLK1) 的表達(dá)增加。而且，PTEN 水平降低也會(huì)導(dǎo)致抗性表型，降低了 T-DM1 和曲妥珠單抗的作用。同時(shí)，PTEN 的缺失和編碼PI3K催化亞基 (PIK3CA) 的基因激活突變又會(huì)導(dǎo)致 PI3K/AKT 通路的組成性激活，也成為HER2受體治療的耐藥性機(jī)制。

最近，在對(duì) T-DM1 獲得性耐藥的 HER2 陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞系中觀察到抗微管蛋白藥物的耐藥性增加。這些細(xì)胞的聚合微管蛋白和βIII微管蛋白水平較低，基線非整倍性增加。然而，親本系中微管蛋白βIII的沉默不足以產(chǎn)生對(duì)T-DM1的抗性，表明耐藥性的原因可能涉及多種因素，包括微管/微管蛋白復(fù)合物的修飾和染色體不穩(wěn)定性。

如何管理ADC的耐藥問(wèn)題

如何管理ADC藥物的耐藥問(wèn)題，自然也要從耐藥機(jī)制出發(fā)，清晰每一種藥物或表現(xiàn)出的耐藥模式選擇合適的應(yīng)對(duì)策略。

比如針對(duì)藥物外排泵，有效的策略就是替換一種外排泵不能主動(dòng)泵出的藥物形式，包括替換為不同載荷、不同偶聯(lián)技術(shù)的新型ADC藥物或載荷的修飾物，如基于馬來(lái)酰亞胺的親水接頭PEG4Mal替換的DM1，使其變成了Lys-PEG4Mal-DM1，避免了被排出。當(dāng)然，也可以選擇降低藥物外排泵活力的藥物，減少活性代謝物外排。

面對(duì)HER2的改變，包括內(nèi)化、循環(huán)和二聚體，也可以采取相應(yīng)的措施。對(duì)于HER2再循環(huán)可以加入抑制循環(huán)加速的HSP90 抑制劑，不僅可減少 HER2 再循環(huán)還可以誘導(dǎo) HER2 在細(xì)胞內(nèi)囊泡中的定位，從而改善HER2的降解。對(duì)于二聚體，可以采用HER3抗體或HER2/HER3雙特異性抗體，當(dāng)然目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有這些藥物上市。

面對(duì)通路激活的耐藥情況，相對(duì)而言已經(jīng)有更多的經(jīng)驗(yàn)和藥物，比如聯(lián)合使用小分子HER2抑制劑或PI3K/AKT和MAPK/ERK通路的抑制劑。聯(lián)合用藥不僅是一種對(duì)抗耐藥性的有效策略，也可以是一種增效的治療手段，傳統(tǒng)化療中就有很多組合療法。而對(duì)于ADC藥物，同樣可以聯(lián)合小分子藥物、PD-1/L1免疫藥物等。

寫在最后：ADC代表了一類具有高抗腫瘤活性的藥物，但國(guó)內(nèi)的應(yīng)用尚沒(méi)有完全普及，耐藥性的種類和應(yīng)對(duì)經(jīng)驗(yàn)還需要積累?？偟膩?lái)說(shuō)，針對(duì)HER2 ADC藥物的耐藥機(jī)制多樣，需要結(jié)合抗體、溶酶體、載荷等多方面的因素共同分析。目前，沒(méi)有更多的針對(duì) T-DXd或其他HER2 ADC藥物耐藥機(jī)制的描述，但預(yù)計(jì)針對(duì)曲妥珠單抗、帕妥珠單抗和/或T-DM1描述的一些機(jī)制可以外推至T-DXd及其他使用相同抗體或技術(shù)的HER2 ADC藥物。

參考文獻(xiàn)

1、Cancers 2022, 14, 154. https://doi.org/10.3390/cancers14010154.