今日，三篇關(guān)于基因編輯的重要論文上線，向我們展示了這一領(lǐng)域的無限可能。其中兩篇發(fā)表于《自然-生物技術(shù)》的論文拓展了現(xiàn)有技術(shù)的邊界，有望將所能編輯的基因長度擴(kuò)展一百倍！而另一篇在《細(xì)胞》雜志上發(fā)表的論文，則進(jìn)一步對一項(xiàng)基因編輯技術(shù)進(jìn)行了改良。這些發(fā)現(xiàn)的問世，宣告了基因編輯又往前邁了一大步。

而說到這些進(jìn)展，則離不開一個名字——劉如謙（David Liu）。

先導(dǎo)編輯

時(shí)間回溯到2019年10月22日。兩年前，劉如謙教授團(tuán)隊(duì)在《自然》雜志上發(fā)表了一篇重要論文，帶來了一種叫做“先導(dǎo)編輯” （prime editing）的全新基因編輯技術(shù)。論文上線后引來業(yè)內(nèi)的點(diǎn)贊和熱議，被認(rèn)為是“極為重要”的成果。

在這項(xiàng)技術(shù)誕生之前，傳統(tǒng)的CRISPR基因編輯技術(shù)會使用Cas9蛋白，在目標(biāo)DNA上切出口子，造成雙鏈DNA斷裂。隨后，DNA會利用同源重組等方法，在修復(fù)過程中對基因組進(jìn)行編輯。

這一方法雖然有效，但很粗暴。打個比方，這就好像一頁書上有錯別字，為了修正書上的錯誤，要把這整頁書給撕下來，再重新粘上一頁那樣?？梢韵胂?，這樣的工作談不上優(yōu)雅，也容易產(chǎn)生潛在的問題。

▲傳統(tǒng)的CRISPR-Cas9基因編輯方法示意圖（圖片來源：J LEVIN W [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]）

而先導(dǎo)編輯則不同。它的核心是一種由經(jīng)改造的Cas9蛋白與逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）融合而成的特殊蛋白，另一個關(guān)鍵是一種特殊的gRNA——pegRNA（pe是先導(dǎo)編輯的縮寫）。它不但能夠結(jié)合想要進(jìn)行編輯的特定DNA區(qū)域，還自帶“修改模板”。Cas9-逆轉(zhuǎn)錄酶融合蛋白會在pegRNA的引導(dǎo)下，精準(zhǔn)地切開一條DNA鏈，然后根據(jù)模板，合成含有正確序列的DNA。細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制會自動把這段新合成的序列整合進(jìn)基因組。

▲先導(dǎo)編輯技術(shù)的示意圖（圖片來源：Susanna Hamilton, Broad Institute）

在多種人類細(xì)胞中，研究人員們證實(shí)了這一系統(tǒng)的編輯能力。此外，它的編輯潛力在小鼠神經(jīng)元里也得到了證實(shí)。除了對單個堿基進(jìn)行修改之外，這一系統(tǒng)還能夠插入或刪除特定的DNA序列。根據(jù)論文，研究人員們最多可以插入44個堿基，或是刪除80個堿基。

這對于治療人類遺傳病有著重要意義。據(jù)估計(jì)，大約89%的已知人類致病變異，有望通過這一新型基因編輯技術(shù)來修復(fù)。

從一百到一萬

先導(dǎo)編輯在問世后得到了廣泛的應(yīng)用，然而卻有一個瓶頸尚未突破——它只能對有限長度的基因進(jìn)行刪除。如果一段序列超過100個堿基，就會影響這套系統(tǒng)的編輯效率。

今日兩篇發(fā)表在《自然-生物技術(shù)》上的論文則突破了這一瓶頸。兩支獨(dú)立的團(tuán)隊(duì)各自開發(fā)了優(yōu)化的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)，可一次性精準(zhǔn)切除至多10000個堿基！這大大拓展了先導(dǎo)編輯的應(yīng)用場景。

第一項(xiàng)研究來自馬薩諸塞大學(xué)的薛文教授課題組。與先導(dǎo)編輯中使用的改造Cas9蛋白不同，他們使用了具有完整功能的Cas9蛋白，再將其與逆轉(zhuǎn)錄酶融合在一起。這樣的融合蛋白一次能切開兩條DNA鏈。

同時(shí)，他們也額外加入了一條pegRNA（共兩條），靶向DNA上互補(bǔ)的序列。而逆轉(zhuǎn)錄酶合成的兩段新DNA則形成互補(bǔ)的黏性末端。當(dāng)這兩個末端相結(jié)合時(shí)，就可以將原本位于中間的大段DNA給刪除掉。這一技術(shù)至多能刪去將近一萬個堿基。

▲本技術(shù)的圖示（圖片來源：參考資料[1]）

薛文教授指出，有大約14%的突變類型涉及到大段的插入、復(fù)制、或是復(fù)雜的DNA重組。這些難以用傳統(tǒng)的CRISPR技術(shù)去解決。而這一工具有望為帶有這些突變的患者帶來希望。

盡管這一技術(shù)目前無法應(yīng)用于人類，但研究人員們在小鼠中做了概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在一種由于大段DNA插入引起的酪氨酸血癥小鼠中，研究人員們應(yīng)用這套新型先導(dǎo)編輯，成功治療了它們的疾病。在挪走一段長達(dá)1300多堿基的致病序列后，小鼠能成功產(chǎn)生原本缺乏的蛋白，恢復(fù)健康。相比之下，對照組小鼠則飽受肝臟損傷的困擾。

第二項(xiàng)研究來自華盛頓大學(xué)的Jay Shendure教授課題組。與第一項(xiàng)研究略有不同，研究人員們還是使用了先導(dǎo)編輯最初使用的特殊Cas9蛋白，即每次能切開一條DNA。但在兩條pegRNA的作用下，它同樣能達(dá)成刪除中間序列的效果。

在人類的腎臟細(xì)胞中，研究人員們做了一系列刪除測試，范圍從20個堿基到10000個堿基不等。盡管編輯效率還不是非常高，但這些實(shí)驗(yàn)的積極結(jié)果驗(yàn)證了這一技術(shù)的可行性。更關(guān)鍵的是，編輯的成功與否，并不取決于刪除序列的長短，更多取決于選擇的序列。這也進(jìn)一步表明進(jìn)行大段DNA刪除的可行性。

▲本技術(shù)的圖示（圖片來源：參考資料[2]）

研究人員們指出，我們的基因組里有大段所謂的“垃圾DNA”。它們雖然不編碼蛋白，但在基因調(diào)控上起到了非常重要的作用。這款新型基因編輯工具的問世，將讓我們更好地研究這些調(diào)控序列的作用。

提高編輯效率

有意思的是，在這兩篇重要論文誕生的當(dāng)天，最初開發(fā)先導(dǎo)編輯的劉如謙教授團(tuán)隊(duì)也在《細(xì)胞》雜志發(fā)文，進(jìn)一步對這款重要工具進(jìn)行改良。

這篇論文提到，盡管先導(dǎo)編輯能精準(zhǔn)地切開DNA，但我們對影響編輯效率的細(xì)胞因素還知之甚少。在本研究中，科學(xué)家們使用基于CRISPR干擾（CRISPRi）的技術(shù)，進(jìn)行了大規(guī)模的篩選，發(fā)現(xiàn)DNA的錯配修復(fù)會影響到先導(dǎo)編輯，產(chǎn)生預(yù)期外的插入/刪除突變。

為此，研究人員們開發(fā)了更先進(jìn)的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)，能瞬時(shí)表達(dá)抑制DNA錯配修復(fù)的蛋白，以提高編輯效率。分析表明，與早期的先導(dǎo)編輯系統(tǒng)相比，新系統(tǒng)的編輯效率要高出2.0到7.7倍。

▲本研究的圖示（圖片來源：參考資料[3]）

而通過優(yōu)化先導(dǎo)編輯所需的蛋白，他們還能進(jìn)一步在海拉細(xì)胞系中提高先導(dǎo)編輯的效率，幅度達(dá)到2.8倍。

注：原文有刪減

參考資料：

[1] Jiang, T., Zhang, XO., Weng, Z. et al. Deletion and replacement of long genomic sequences using prime editing. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01026-y

[2] Choi, J., Chen, W., Suiter, C.C. et al. Precise genomic deletions using paired prime editing. Nat Biotechnol (2021). https://doi.org/10.1038/s41587-021-01025-z

[3] Peter J. Chen et al., (2021), Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes, Cell, DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.018

[4] New CRISPR tools could fix diseases caused by large DNA rearrangements, scientists report, Retrieved October 14, 2021, from https://www.statnews.com/2021/10/14/new-crispr-tools-could-fix-diseases-caused-by-large-dna-rearrangements-scientists-report/