從孟德爾在自己的豌豆田里找到了基因決定生物性狀的秘密，到后來(lái)人類發(fā)現(xiàn)核酸序列能夠編碼生命，再到生物克隆與基因編輯，基因技術(shù)的發(fā)展讓生命的藍(lán)圖變得逐漸清晰。

我們都是從精子和卵子的結(jié)合發(fā)育而來(lái)，但是我們身體的細(xì)胞之間卻大不相同：有的細(xì)胞承擔(dān)力量，有的細(xì)胞保護(hù)機(jī)體，雖共享相同的DNA卻展現(xiàn)著不同的形態(tài)和功能。

這一切都源于基因本身在不同細(xì)胞中差異表達(dá)的復(fù)雜性。雖然我們所有的體細(xì)胞都具有基本相同的基因，并不是所有的基因都會(huì)被表達(dá)。這就像我們?cè)诟咧挟厴I(yè)之后，絕大多數(shù)的人都不會(huì)用到圓錐曲線的知識(shí)一樣，盡管我們都學(xué)過(guò)。細(xì)胞具有或執(zhí)行哪些基因，能夠通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中的核酸序列，來(lái)判斷細(xì)胞正在表達(dá)哪些基因，也就可以推斷細(xì)胞在進(jìn)行怎樣的任務(wù)。

單細(xì)胞測(cè)序作為可以高效檢測(cè)不同細(xì)胞中基因異質(zhì)性表達(dá)的工具，被推上了時(shí)代的前沿，成為了生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)強(qiáng)勁技術(shù)。我們也能夠通過(guò)這個(gè)技術(shù)，分析我們身體中形形色色的細(xì)胞的差異和起源，幫助我們對(duì)抗疾病。

為什么要單細(xì)胞RNA測(cè)序？

細(xì)胞的特性被它所具有的DNA決定，多細(xì)胞生物由單一受精卵復(fù)制分化而來(lái)，意味著一個(gè)生命個(gè)體中的所有細(xì)胞都共享了DNA。即使具有高度相似的DNA，細(xì)胞們卻各不相同，這其中就包括癌細(xì)胞。癌細(xì)胞和其它體細(xì)胞共享了同一套遺傳信息，但是它的行為卻完全不是我們身體所希望的。

如何把藏在身體里的癌細(xì)胞揪出來(lái)，成為了醫(yī)學(xué)上的一大難題。

癌細(xì)胞和其它正常細(xì)胞的區(qū)別很小，可能只是某一個(gè)基因的一個(gè)位點(diǎn)突變，或者在表達(dá)上將一個(gè)蛋白多合成了一點(diǎn)，就將這個(gè)細(xì)胞推向了不歸路。這些微小卻又關(guān)鍵的突變，需要仔細(xì)的甄別篩選，如果我們一口氣對(duì)一大片組織測(cè)序，這些細(xì)小的差異就可能被當(dāng)作誤差忽略掉，讓我們錯(cuò)過(guò)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞。

因此，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)排查，對(duì)于癌癥治療是必要的。

直接對(duì)細(xì)胞的蛋白分析是困難的。細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，分離這些蛋白又是極其困難的事情，這使得我們無(wú)法對(duì)單個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)精確分析。我們沒(méi)有必要蹲在蛋糕店門口數(shù)有多少個(gè)客人買了蛋糕，找到賬本是更快捷的方式：科學(xué)家們便將目光瞄準(zhǔn)在決定蛋白質(zhì)表達(dá)的“賬本”mRNA上。

mRNA是基因表達(dá)的信使，當(dāng)一個(gè)基因需要被翻譯成蛋白時(shí)，會(huì)先轉(zhuǎn)錄出對(duì)應(yīng)的mRNA。一個(gè)蛋糕店什么蛋糕在熱賣，分析后廚訂單的打印數(shù)量即可：我們也能分析mRNA的種類與數(shù)量，判斷一個(gè)細(xì)胞的運(yùn)行情況。相比于蛋白質(zhì)，mRNA信號(hào)能夠精確放大，使得單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)能夠更容易得出細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)種類及數(shù)量，從而判斷細(xì)胞潛在的功能。

除了腫瘤，單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)還可以檢測(cè)胚胎發(fā)育階段不同細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜，從而篩選出不同器官發(fā)育時(shí)期的關(guān)鍵基因，為干細(xì)胞器官移植提供參考。

另外，我們也可以直接對(duì)癌細(xì)胞中常見(jiàn)的DNA突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，分析這些關(guān)鍵DNA序列是否有潛在的變異風(fēng)險(xiǎn)，從而判斷這一細(xì)胞的情況。

目前，單細(xì)胞測(cè)序已經(jīng)應(yīng)用于腫瘤檢測(cè)、胚胎發(fā)育、免疫細(xì)胞治療及干細(xì)胞分化等等一系列生物醫(yī)學(xué)的研究和臨床試驗(yàn)中，為人類探索生命秘密與對(duì)抗疾病做出了十分重要的貢獻(xiàn)。

如何實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞測(cè)序？

單細(xì)胞測(cè)序的步驟非常簡(jiǎn)單，只需要三步：提取核酸，測(cè)序，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。而對(duì)于mRNA測(cè)序，一般需要將mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA提高測(cè)序的穩(wěn)定性。

對(duì)于單個(gè)細(xì)胞測(cè)序，我們也就只需要將每一個(gè)細(xì)胞分離出來(lái)，再對(duì)細(xì)胞單獨(dú)測(cè)序就好了。

逐個(gè)分析這樣的測(cè)序思路：通過(guò)流式細(xì)胞分選或者激光捕獲顯微切割等技術(shù)將單個(gè)細(xì)胞分離，再進(jìn)行核酸提取。但這樣的方法，像把米一粒粒從谷子里剝出來(lái)，而面對(duì)一個(gè)組織樣本上萬(wàn)的細(xì)胞數(shù)量，這樣測(cè)序顯然是杯水車薪。

標(biāo)簽（barcode）的巧妙應(yīng)用讓單細(xì)胞識(shí)別提高了效率：我們不需要挨個(gè)分離并提取出單個(gè)細(xì)胞，只需要給每個(gè)細(xì)胞加上一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的核酸序列標(biāo)簽再測(cè)序分析即可。

這種策略就好像銀行的取號(hào)排隊(duì)系統(tǒng)：將不同的客戶打上不同的標(biāo)記，并分配特定的窗口，按需排隊(duì)。無(wú)數(shù)的“大堂經(jīng)理”水凝膠將不同的“核酸標(biāo)簽”編號(hào)交給不同的顧客，并帶著顧客們一個(gè)個(gè)排隊(duì)進(jìn)入大廳辦理“測(cè)序”業(yè)務(wù)。一次實(shí)驗(yàn)，就能測(cè)得數(shù)百上千個(gè)單細(xì)胞的信息。

此外，對(duì)單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果的驗(yàn)證是有必要的，常用的方法是Bulk（混池）測(cè)序與蛋白質(zhì)組學(xué)分析。Bulk測(cè)序通過(guò)直接整體對(duì)組織測(cè)序，它和單細(xì)胞測(cè)序相輔相成。Bulk測(cè)序就像把所有水果丟在一起榨出的綜合果蔬汁，它能夠來(lái)與單細(xì)胞測(cè)序的結(jié)果比對(duì)，判斷單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果與整體之間的關(guān)系，進(jìn)而精準(zhǔn)定義“異�！�。蛋白質(zhì)組學(xué)則直接分析細(xì)胞群中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，與mRNA測(cè)序形成呼應(yīng)。

DNA是怎么被測(cè)序的？

最早的基因測(cè)序技術(shù)是基于DNA復(fù)制過(guò)程，將DNA的序列信息轉(zhuǎn)變?yōu)榭勺x的信號(hào)。

基因的復(fù)制過(guò)程像拼接樂(lè)高積木：以一條原有的DNA鏈為模板，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)，DNA合成酶將核苷酸一個(gè)個(gè)的拼接在一起。

一代測(cè)序（Sanger法）利用DNA聚合酶合成反應(yīng)(PCR)，向正常的PCR反應(yīng)體系中摻入少量放射性同位素標(biāo)記的ddNTP來(lái)測(cè)完一條完整的DNA序列。

ddNTP特殊的結(jié)構(gòu)會(huì)終止PCR反應(yīng)，像一個(gè)沒(méi)有凸起的樂(lè)高積木一樣，后面的積木無(wú)法再繼續(xù)鏈接，因此積木就無(wú)法繼續(xù)延長(zhǎng)了。由于ddNTP在整個(gè)PCR反應(yīng)中出現(xiàn)的位置是隨機(jī)的， PCR反應(yīng)可以在任意位置終止，如果我們讓該堿基所有出現(xiàn)的位點(diǎn)，都至少出現(xiàn)一次合成終止，每一個(gè)終止的位置就是該堿基出現(xiàn)的位置；最后通過(guò)凝膠電泳和放射性自顯影成像，我們就可以得到所有終止位點(diǎn)的堿基信息，從而獲得一條完整的DNA序列。

一代測(cè)序最為簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度也較高，但是一次只能測(cè)有限的長(zhǎng)度。就像玩貪吃蛇一樣，玩到后面蛇越長(zhǎng)越難操控，一代測(cè)序也是越長(zhǎng)越不穩(wěn)定。一代測(cè)序最長(zhǎng)也就能測(cè)1000bp左右的序列，對(duì)較長(zhǎng)的測(cè)序無(wú)從下手，面對(duì)上億堿基的全基因組更是毫無(wú)應(yīng)對(duì)辦法。

既然我們不能一次測(cè)完全部的序列，我們可以測(cè)基因組的一部分，再拼接在一起呀！

二代測(cè)序（Next Generation Sequencing, NGS）正是基于“鳥槍法”將冗長(zhǎng)的基因組打碎，再分別測(cè)序片段，最后拼接成完整的序列。由于常見(jiàn)物種詳盡的DNA文庫(kù)已經(jīng)完成構(gòu)建，在診療應(yīng)用中，我們只需要一小段DNA與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，就可以在這個(gè)文庫(kù)中找出原始DNA。整個(gè)過(guò)程就像搜索一樣，而不需要像拼拼圖一樣尋找一塊又一塊關(guān)聯(lián)的序列片段。

雖然二代測(cè)序仍然基于PCR的DNA擴(kuò)增過(guò)程，但它運(yùn)用了“邊合成邊測(cè)序”的原理，讓四種堿基在DNA合成期間產(chǎn)生各自特異的熒光信號(hào)，同步使用精密光學(xué)攝像頭捕捉，直接即時(shí)讀取堿基信息。

二代測(cè)序極大的提高了測(cè)序的通量，降低了測(cè)序成本和周期，且自動(dòng)化程度高，一舉成為現(xiàn)今市場(chǎng)上最矚目的測(cè)序技術(shù)。

二代測(cè)序依然有自身的缺點(diǎn)：?jiǎn)蝹�(gè)堿基的熒光很弱，光學(xué)儀器讀取容易出現(xiàn)誤差；測(cè)序片段需要復(fù)制擴(kuò)增，復(fù)制過(guò)程會(huì)偶爾發(fā)生堿基的錯(cuò)配和丟失，這些錯(cuò)誤會(huì)因?yàn)闇y(cè)序樣本量的增加而累積；單次測(cè)序長(zhǎng)度較小，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)容易出現(xiàn)錯(cuò)配。

由于這些技術(shù)缺陷，使得人們對(duì)無(wú)需擴(kuò)増、讀長(zhǎng)更長(zhǎng)的技術(shù)便呼之欲出。

三代測(cè)序在保留了二代測(cè)序的高通量特征的同時(shí)，利用單分子讀取技術(shù)，不再需要PCR中的擴(kuò)增過(guò)程，有效減少了因?yàn)閿U(kuò)增而導(dǎo)致的堿基信息的丟失和錯(cuò)配，并且將測(cè)序長(zhǎng)度提高到了10kb左右。

目前，第二、三代測(cè)序技術(shù)均是基于捕捉微弱的熒光信號(hào)，因此需要配備昂貴的光學(xué)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)；基于DNA復(fù)制的原理使得他們過(guò)度依賴DNA聚合酶的活性，這些特性都大大地増加了測(cè)序的成本。

第四代測(cè)序技術(shù)則嘗試在不需要DNA合成的條件下完成測(cè)序。

第四代測(cè)序通過(guò)引物將待測(cè)序列通過(guò)一個(gè)納米孔，讀取不同堿基通過(guò)納米孔時(shí)的電信號(hào)差異來(lái)實(shí)時(shí)測(cè)序。這一技術(shù)不僅降低了儀器和耗材開銷的同時(shí)也能夠獲得優(yōu)秀的精確度，還能夠做到減少機(jī)械體積，將原本臺(tái)式機(jī)那么大的測(cè)序儀器做到U盤大小。齊碳科技研制出的第一臺(tái)國(guó)產(chǎn)第四代測(cè)序儀，為大范圍的單細(xì)胞測(cè)序臨床應(yīng)用提供技術(shù)保障。

單細(xì)胞RNA測(cè)序的應(yīng)用與未來(lái)

2009年，第一種單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)mRNA-Seq掀開了單細(xì)胞測(cè)序在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中舉足輕重的歷史。2014年單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)被國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)雜志《自然-方法》評(píng)為年度技術(shù)。同年，《科學(xué)》雜志將單細(xì)胞測(cè)序列為年度最值得關(guān)注的領(lǐng)域榜首，認(rèn)為該技術(shù)給生物界和醫(yī)學(xué)界帶來(lái)前所未有的改變。

2017年，一個(gè)媲美“人類基因組計(jì)劃”的“人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃”誕生�！叭祟惣�(xì)胞圖譜計(jì)劃”是一項(xiàng)國(guó)際化的大型合作項(xiàng)目，其目的是根據(jù)獨(dú)特的生物大分子信息，對(duì)所有人類細(xì)胞進(jìn)行功能分型和定義。這個(gè)計(jì)劃中一項(xiàng)極其關(guān)鍵的技術(shù)就是單細(xì)胞RNA測(cè)序。單細(xì)胞RNA測(cè)序可以揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的不同點(diǎn)，其在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

在不久的將來(lái)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠?qū)⒕珳?zhǔn)醫(yī)療推向更廣闊的空間，更多的患者能夠享受負(fù)擔(dān)得起的特異性高效療法，提高治療效率和治療過(guò)程的體驗(yàn)。

單細(xì)胞RNA測(cè)序作為時(shí)代的弄潮兒，已經(jīng)成為生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中不可或缺的技術(shù)�，F(xiàn)如今在腫瘤、發(fā)育生物學(xué)、微生物學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和突變，將使單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在未來(lái)疾病精準(zhǔn)研究與治療具有十分廣闊的應(yīng)用前景，在人類健康的舞臺(tái)上綻放更加絢爛的光芒。

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