近期，Nature子刊 Gene Therapy 在線發(fā)表了題為 “Gene therapy development in hearing research in China” 的綜述文章[1]。本文回顧了耳蝸基因轉(zhuǎn)染的手術(shù)路徑和可能的靶點(diǎn)基因，同時(shí)也總結(jié)了基因治療聽力損失的現(xiàn)有臨床試驗(yàn)和當(dāng)前的挑戰(zhàn)。

感音神經(jīng)性聽力損失(Sensorineural hearing loss, SNHL)是最常見的感覺(jué)障礙之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，聽力損失影響著全世界約4.66億人，其中包括3400萬(wàn)兒童。據(jù)最新報(bào)道，中國(guó)大約有2700萬(wàn)人患有致殘聽力損失，其中包括13萬(wàn)兒童。

SNHL由遺傳和非遺傳原因(如噪音暴露、耳毒性藥物)引起，在90%的人類聽力損失病例中，SNHL會(huì)導(dǎo)致感覺(jué)細(xì)胞和神經(jīng)元死亡或損傷。迄今為止，已有150多個(gè)基因被確定為非綜合征性和綜合征性聽力損失的病因。此外，導(dǎo)致聽力喪失的衰老和其他外源性因素(如噪音、耳毒性藥物、感染)也往往與特定基因變異相互作用，決定感覺(jué)細(xì)胞和神經(jīng)元損傷的程度。

近幾十年來(lái)，基因療法成為了新興的疾病治療手段。美國(guó)的Luxturna®(voretigene neparvovec，2017)和歐洲的Zolgensma® (onasemnogene abeparvovec，2019)兩種基于腺相關(guān)病毒(AAV)的基因治療藥物已分別被批準(zhǔn)用于治療萊伯氏先天性黑蒙癥和脊髓性肌萎縮癥。耳聾小鼠模型和基因治療技術(shù)的快速發(fā)展使基因療法治療聽力損失成為可能。

目前已測(cè)試了幾種用于耳蝸基因治療的方法，包括(1)用野生型序列替代引起耳聾的功能缺失突變基因序列；(2)通過(guò)短干擾RNA (short interfering RNA, siRNA)或基因編輯技術(shù)等遺傳干擾手段，敲除或失活獲得功能突變相關(guān)的基因；以及(3)將新基因?qū)爰?xì)胞以減輕或防止?jié)u進(jìn)性聽力損失?；騻鬟f載體的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的發(fā)展，以及對(duì)耳聾相關(guān)分子遺傳和生物學(xué)機(jī)制的迅速了解，使耳蝸基因治療領(lǐng)域取得了巨大進(jìn)步。

耳蝸基因轉(zhuǎn)染的手術(shù)路徑

耳蝸的基因轉(zhuǎn)染可以通過(guò)向耳蝸外淋巴管或內(nèi)淋巴管注入靶基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)耳蝸造口術(shù)、管道造口術(shù)或圓窗膜（round window Membrane, RWM）路徑已經(jīng)發(fā)展出了幾種手術(shù)路徑 (圖1)。雖然耳蝸造口術(shù)提供了相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率，但由于耳蝸內(nèi)部結(jié)構(gòu)損傷，該方法存在較高的聽力損失風(fēng)險(xiǎn)。理想的傳遞方法是以最小的損傷提高轉(zhuǎn)染效率。最近，Jun等研究表明，在成年小鼠中管道造口術(shù)是合適的，不會(huì)引起聽覺(jué)障礙。RWM方法是臨床小分子轉(zhuǎn)染的可行方法。之前，實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)膠原酶預(yù)處理的RWM可以提高成年豚鼠和新生小鼠的病毒穿透效率。耳蝸基因治療還需要在大型動(dòng)物模型上進(jìn)一步驗(yàn)證。最近，Yang等人通過(guò)RWM和后規(guī)管入路將AAV1-CMV-GFP送入Bama小型豬耳蝸，結(jié)果表明，在大型動(dòng)物模型中，管道造口術(shù)是一種理想的內(nèi)耳基因傳遞手術(shù)選擇。

圖1 耳蝸結(jié)構(gòu)及手術(shù)注射路徑示意圖

可能成為基因治療的靶點(diǎn)基因

SNHL通常是由基因突變、感染、自身免疫性內(nèi)耳疾病、耳毒性藥物、過(guò)度接觸噪音和衰老引起的。然而，大多數(shù)聽力損失是由遺傳易感性造成的。這里，本文總結(jié)了中國(guó)導(dǎo)致先天性聽力喪失的遺傳因素以及可能成為基因治療的靶點(diǎn)基因(表1)。

表1 中國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證的導(dǎo)致先天性聽力損失的基因

目前的臨床試驗(yàn)

目前，基因治療聽力損失的臨床試驗(yàn)仍處于初級(jí)階段。本文搜索了美國(guó)和歐盟的臨床試驗(yàn)注冊(cè)網(wǎng)站以及世界衛(wèi)生組織的國(guó)際臨床試驗(yàn)注冊(cè)平臺(tái)，使用以下搜索詞“genetic modulation”, “gene therapy”, “genetic therapy” 和 “hearing loss”, “deafness”,

“hearing disorders”，查到四個(gè)正在進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)。

第一項(xiàng)臨床試驗(yàn)由諾華公司贊助，I期臨床試驗(yàn)評(píng)估內(nèi)耳迷路內(nèi)輸注CGF166治療深度聽力損失的安全性、耐受性和有效性。CGF166是一種重組腺病毒5載體，含有編碼人類無(wú)調(diào)性轉(zhuǎn)錄因子(Hath1)的cDNA(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02132130)。

第二項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，Gary Housley教授在澳大利亞悉尼對(duì)人工耳蝸植入患者進(jìn)行了I/II期非隨機(jī)、多中心、對(duì)照評(píng)估，以評(píng)估編碼神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(BDNF和NT3)裸DNA的安全性和有效性(ACTRN12618001556235)。

第三項(xiàng)臨床試驗(yàn)是在倫敦進(jìn)行的I/II期臨床試驗(yàn)，評(píng)估Notch抑制劑LY3056480治療輕中度SNHL的安全性和有效性(http://www.isrctn.com/ISRCTN59733689)。經(jīng)鼓室注射LY3056480，干預(yù)劑量遞增。

第四項(xiàng)臨床試驗(yàn)正在法國(guó)進(jìn)行，目的是評(píng)估AAV載體在人造血干細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。簡(jiǎn)單地說(shuō)，分離人造血干細(xì)胞，并探討了AAV在體外轉(zhuǎn)染人造血干細(xì)胞的有效性(clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT03996824)。

到目前為止，我國(guó)還沒(méi)有對(duì)聽力損失患者進(jìn)行基因治療的臨床試驗(yàn)。然而，我們相信，隨著技術(shù)在臨床前試驗(yàn)中不斷應(yīng)用，未來(lái)將有更多的患者受益于基因治療。

最近，Decibel Therapeutics公司推出了針對(duì)耳畸蛋白（otoferlin）缺乏(DB-OTO)的基因治療項(xiàng)目(https://www.decibeltx.com/pipeline/)。臨床前研究正在進(jìn)行中，相關(guān)的人體臨床試驗(yàn)預(yù)計(jì)將于2021年開始。

耳蝸基因治療的挑戰(zhàn)

目前，耳蝸基因治療仍面臨一定的挑戰(zhàn)，需要先進(jìn)的測(cè)序技術(shù)來(lái)識(shí)別其他參與遺傳性聽力損失致病過(guò)程的基因。雖然大多數(shù)成功的治療集中在單基因遺傳性耳聾，但是單基因遺傳性耳聾患者人數(shù)相對(duì)較少。到目前為止，在進(jìn)行性聽力損失中功能基因之間的復(fù)雜關(guān)系還沒(méi)有得到充分的闡明。

同時(shí)，基因治療的效果會(huì)受到采用的治療策略、受影響的耳蝸細(xì)胞以及引入候選基因的治療干預(yù)窗口等因素多種因素的影響。確保靶基因在特定細(xì)胞類型中精確表達(dá)，避免脫靶效應(yīng)是耳蝸基因治療研究者面臨的主要技術(shù)障礙。此外，盡管在小鼠聽力損失模型中，基因治療研究取得了巨大進(jìn)展，但仍需要更大規(guī)模的動(dòng)物模型研究來(lái)確保這些方法的有效性。綜上所述，基因傳遞載體的安全性、靶細(xì)胞特異性、轉(zhuǎn)染效率以及長(zhǎng)期表達(dá)穩(wěn)定性都受到技術(shù)因素的限制。

總之，考慮到耳蝸解剖學(xué)上與鄰近器官相對(duì)隔離，耳蝸基因治療具有不可估量的優(yōu)勢(shì)。雖然耳蝸基因治療遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于基因治療視力喪失，但是耳蝸基因治療的未來(lái)是充滿希望的。聽力損失基因療法應(yīng)用到現(xiàn)實(shí)世界還需要進(jìn)一步改進(jìn)。從技術(shù)上講，需要具有更高轉(zhuǎn)染效率、更精確細(xì)胞特異性和更少脫靶效應(yīng)的載體。此外，與獲得性聽力損失相關(guān)的機(jī)制和關(guān)鍵基因仍有待闡明，未來(lái)的研究將可能為基因操作提供更準(zhǔn)確的靶點(diǎn)。幸運(yùn)的是，中國(guó)和世界各地的科學(xué)家都專注于探索和改進(jìn)治療聽力損失的新技術(shù)，以及其潛在機(jī)制。我們對(duì)聽力損失的基因治療的未來(lái)持樂(lè)觀態(tài)度，這將涉及世界范圍內(nèi)病毒學(xué)家、遺傳學(xué)家、聽力學(xué)家和耳鼻喉學(xué)家的持續(xù)合作。

參考文獻(xiàn)

[1] https://www.nature.com/articles/s41434-020-0177-1,doi.org/10.1038/s41434-020-0177-1