什么是PPI（protein?protein interaction）？答：PPI又稱作蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，通常是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，這些相互作用的失調(diào)通常會(huì)導(dǎo)致疾?。ɡ绨┌Y）的發(fā)生。因此通過調(diào)節(jié)這些相互作用位點(diǎn)有利于探索疾病治療的新方法。目前，大部分研究主要以在生理?xiàng)l件下自然形成的蛋白間相互作用（native protein?protein interaction）作為藥物開發(fā)靶標(biāo)，而對(duì)于調(diào)控非天然蛋白間相互作用靶點(diǎn)（non-native protein?protein interaction）的研究則鮮有報(bào)道[1, 2]。

研究亮點(diǎn)

近日，來自臺(tái)灣國立中興大學(xué)的候明宏團(tuán)隊(duì)解析了MERS-CoV N-NTD（中東呼吸綜合征冠狀病毒-核衣殼（N）蛋白中的N末端域）的非天然二聚體晶體構(gòu)型，并以其非天然蛋白間的接觸界面作為篩選的靶點(diǎn)，從Acros和ZINC藥物數(shù)據(jù)庫中篩選出具有抗冠狀病毒作用的先導(dǎo)化合物 P3 (5-芐基氧代精氨酸)。該工作發(fā)表于Journal of Medcine Chemistry上[1]。

圖1：參考文獻(xiàn)1截圖

研究思路

中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）將其基因組包裝在核衣殼（N）蛋白中，形成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體。RNP對(duì)于病毒的轉(zhuǎn)錄和組裝至關(guān)重要。因此，通過小分子調(diào)節(jié)MERS-CoV核衣殼（N）蛋白寡聚來破壞病毒核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體的形成是一種可行的抗病毒藥物開發(fā)策略。MERS-CoV核衣殼（N）蛋白包含N末端域（NTD）和C末端域（CTD），這兩個(gè)域都會(huì)參與RNA結(jié)合。MERS-CoV N-NTD結(jié)構(gòu)（核衣殼（N）蛋白中的N末端域）以單體構(gòu)型折疊。而MERS-CoVN-CTD（核衣殼（N）蛋白中的C末端域）則始終是天然二聚體，并通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致核衣殼（N）蛋白寡聚?？偟膩碚f，這個(gè)工作的設(shè)計(jì)思路就是利用MERS-CoV N-CTD天然的蛋白間相互作用的特點(diǎn)使單體的MERS-CoVN-NTD互相靠近，從而形成非天然的蛋白與蛋白間作用位點(diǎn)，然后以此位點(diǎn)作為抗病毒藥物設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)。

圖2：抗冠狀病毒藥物設(shè)計(jì)策略。圖片來源于參考文獻(xiàn)1

非天然二聚體界面的晶體結(jié)構(gòu)解析

為了進(jìn)一步了解該靶點(diǎn)的具體特點(diǎn)以及篩選抑制劑，該團(tuán)隊(duì)首先解析了MERS-CoV N-NTD非天然蛋白間作用位點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)。作者將相互作用的MERSCoV N-NTD蛋白二聚體命名為單體1和2，再將二聚體界面分為兩個(gè)區(qū)域：一個(gè)位于N末端柔性區(qū)，另一個(gè)位于N蛋白的β4和β5之間的環(huán)上。在第一個(gè)區(qū)域中，單體1的W43，N66，N68，Y102和F135產(chǎn)生了一個(gè)保守的疏水口袋，而單體2的M38的側(cè)鏈則能通過疏水接觸進(jìn)入單體1的疏水口袋。此外，單體2的H37和N39則分別與單體1的W43和F135堆積，并有助于界面疏水作用。單體2與單體1之間的氫鍵作用則主要包括N39的側(cè)鏈與N68主鏈形成氫鍵，以及殘基G104，F(xiàn)135和T137的主鏈氧與Q73和T134的側(cè)鏈形成三個(gè)氫鍵。在進(jìn)一步的研究中，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)二聚體狀態(tài)是否穩(wěn)定，需要通過單體2上的殘基H37，M38來維持二聚體狀態(tài)。此外，如果W43A突變會(huì)顯著降低了N-NTD的寡聚趨勢。還有一個(gè)重要的特點(diǎn)就是該二聚體界面具有疏水性。在這里，筆者不禁想說的是，對(duì)于藥物的設(shè)計(jì)，靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)的解析往往至關(guān)重要，能夠讓我們更加有目標(biāo)和方向。就如同生病吃藥，必須對(duì)癥下藥，才能藥到病除。從晶體結(jié)構(gòu)我們可以了解到靶點(diǎn)的活性位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)性質(zhì)、相互作用的位置等等，對(duì)接下來的全新藥物設(shè)計(jì)具有很好的指導(dǎo)意義。

圖3：MERS-CoV N-NTD的非天然二聚體界面結(jié)構(gòu)。圖片來源于參考文獻(xiàn)1

先導(dǎo)化合物的篩選策略

那么，對(duì)非天然二聚體界面相互作用的解析以及界面的疏水性對(duì)于接下來先導(dǎo)化合物的篩選應(yīng)該給予什么啟發(fā)？而且該團(tuán)隊(duì)又是怎樣設(shè)計(jì)篩選策略的呢？

首先依據(jù)對(duì)非天然二聚體界面相互作用位點(diǎn)的解析結(jié)果，該研究團(tuán)隊(duì)從模板中除去了H37和M38，以鑒定可以替代載體融合殘基的化合物，并以N-NTD二聚體界面的疏水口袋中的W43進(jìn)行了基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，初步篩選到了系列的配體。經(jīng)筆者的分析，采用這個(gè)策略的主要原因是W43會(huì)影響MERS-Cov N-NTD蛋白的寡聚，以及H37和M38是維持二聚體界面穩(wěn)定的主要?dú)埢?

然后基于非天然二聚體界面的疏水性的性質(zhì)，該團(tuán)隊(duì)以所獲得的配體N-NTD之間的疏水互補(bǔ)性（SL/L）和低拓?fù)錁O性表面積（TPSA）為標(biāo)準(zhǔn)，虛擬篩選出三個(gè)候選化合物：芐基-2-（羥甲基）-1二氫吲哚羧酸酯（P1），臨床藥物依托度酸（P2）和5-芐氧基谷氨酰胺（P3）。相較于化合物P1和P2，5-芐氧基谷氨酰胺（P3）具有較高的親脂性匹配表面（SL/L）、對(duì)接分?jǐn)?shù)（Socre）以及較低的拓?fù)錁O性表面積（TPSA），并能增加蛋白質(zhì)色氨酸周圍的微環(huán)境的剛性、疏水性以及穩(wěn)定MERS-CoVN-NTD二聚體結(jié)構(gòu)。重要的是，細(xì)胞毒性濃度（CC50=805.32μM）和有效濃度（EC50=32.1μM）實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明P3具有良好的治療指數(shù)。因此，P3是極好的抗MERS-CoV候選抑制劑。

圖4：候選化合物P1, P2及P3的結(jié)構(gòu)式

P3誘導(dǎo)MERS-CoVN蛋白聚集

在篩選出最優(yōu)的先導(dǎo)化合物P3后，接下來該團(tuán)隊(duì)首先要證明的問題就是該化合物是不是同預(yù)期設(shè)計(jì)的策略一樣，能不能誘導(dǎo)冠狀病毒N蛋白聚集？

該團(tuán)隊(duì)使用小角X射線散射（Small Angle X-Ray Scattering，SAXS）研究了P3對(duì)全長MERSCoV N蛋白結(jié)構(gòu)的影響。全長MERS-CoV N蛋白與先導(dǎo)化合物P3結(jié)合后，會(huì)形成大的蛋白聚集體，并通過聚集體中的N-CTD（核衣殼（N）蛋白中的C末端域）自然形成拓?fù)浞忾]的八聚體，從而誘導(dǎo)N蛋白聚集而抑制MERS-CoV RNP（中東呼吸綜合征冠狀病毒核糖核蛋白復(fù)合體）的形成。

圖5：與化合物P3結(jié)合后的蛋白聚集體。圖片來源于參考文獻(xiàn)1

抗病毒活性研究

進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明50μM的P3在48小時(shí)后對(duì)病毒滴度（病毒的毒力，單位體積內(nèi)活病毒具有功能的病毒的量）的影響很小，但能明顯抑制病毒RNA的復(fù)制。而100μM的P3在48小時(shí)后則完全抑制了病毒的產(chǎn)生和復(fù)制。另外，免疫熒光結(jié)果也表明了化合物P3可通過誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)核衣殼（N）蛋白的異常聚集而抑制MERS-CoV活性。

圖6：化合物P3的抗病毒活性研究。圖片來源于參考文獻(xiàn)1

對(duì)抗SARS-Cov-2抑制劑設(shè)計(jì)的啟示

來自中國科學(xué)院等機(jī)構(gòu)的研究人員近日在Cell期刊上（Cell,2020, doi:10.1016/j.cell.2020.03.045）發(fā)表的研究成果表明MERS-Co和SARS-CoV-2蛋白的結(jié)構(gòu)特征相一致[3]。此外，他們也發(fā)現(xiàn)SARS-CoV S表面的刺突糖蛋白（S蛋白）同MERS-CoV一樣都會(huì)被宿主蛋白酶切割為分別負(fù)責(zé)受體識(shí)別和膜融合的S1和S2亞基。而S1可以進(jìn)一步分為核衣殼（N）蛋白中的N末端結(jié)構(gòu)域（N-NTD）和C末端結(jié)構(gòu)域（N-CTD），其SARS-Cov-2的基因組則包裝在核衣殼（N）蛋白中，形成核糖核蛋白（RNP）復(fù)合體。這是不是給了我們些許提示，是不是可以同樣以SARS-Cov-2N-NTD（新型冠狀病毒-核衣殼（N）蛋白中的N末端域）的非天然蛋白間的接觸界面為靶點(diǎn)篩選出在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)異常的全長N蛋白寡聚以及具有抗新型冠狀病毒（SARS-Cov-2）作用的小分子化合物。當(dāng)然，我們也必須要更加具體分析SARS-Cov-2N-NTD（新型冠狀病毒-核衣殼（N）蛋白中的N末端域）的非天然蛋白間作用界面的特點(diǎn)。因?yàn)樾鹿诓《維ARS-Cov-2的基因和特征雖然和MERS-Cov有很高的相似，但是些許的變化，都會(huì)造成其與人體的宿主細(xì)胞結(jié)合能力、傳染能力、致病能力發(fā)生翻天覆地的變化，從而嚴(yán)重危害成千上萬人的身體健康。

結(jié)語

在全球新冠肺炎疫情如此嚴(yán)峻的今天，全新的抗冠狀病毒藥物設(shè)計(jì)策略對(duì)目前正在肆掠和未來的冠狀病毒治療具有重要意義。目前，靶向冠狀病毒的藥物主要為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）、RNA聚合酶、病毒蛋白酶以及病毒3CL水解酶，而以冠狀病毒的非天然蛋白間相互作用界面（non-native protein?protein interaction）作為抗病毒抑制劑篩選靶點(diǎn)是一次新的突破。

相關(guān)參考文獻(xiàn)

[1] Lin Shanmeng etal. Structure-Based Stabilization of Non-native Protein?Protein

Interactions of Coronavirus Nucleocapsid Proteins in Antiviral Drug Design. Journal of

MedicineChemistry.

[2] Jürgen Bosch. PPIinhibitor and stabilizer development in human diseases. DrugDiscovery Today:Technologies.

[3] Wang Qihui et al. Structural and functional basis of SARS-CoV-2 entry by using human

ACE2. Cell.