今日，Broad研究所的著名學(xué)者張鋒教授和他在Broad研究所，麻省理工學(xué)院（MIT）麥戈文腦科學(xué)研究所（McGovern Institute for Brain Research）的合作伙伴一起，公布了他們開發(fā)的新一代新冠病毒CRISPR檢測技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程。今年2月，張鋒教授和他的合作伙伴曾經(jīng)開發(fā)出一項(xiàng)基于CRISPR的新冠病毒檢測技術(shù)，不需要復(fù)雜的設(shè)備，三步檢測僅需約1個(gè)小時(shí)，就能檢查出新冠病毒RNA的存在。

這款最新的檢測手段比2月份的檢測技術(shù)更進(jìn)一步，檢測過程中不需要從患者樣本中純化RNA，并且將檢測新冠病毒所需的化學(xué)反應(yīng)步驟在一個(gè)試管中完成。研發(fā)團(tuán)隊(duì)將它命名為STOP（SHERLOCK Testing in One Pot）。在檢驗(yàn)12個(gè)新冠病毒陽性和5個(gè)新冠病毒陰性樣本的實(shí)驗(yàn)中，這一檢測達(dá)到100%的特異性和97%的靈敏度。不過科學(xué)家們也強(qiáng)調(diào)，這一檢測方法還沒有獲得FDA的批準(zhǔn)，尚不能用于臨床上對新冠病毒感染的診斷。

利用CRISPR檢驗(yàn)新冠病毒的技術(shù)原理

目前，診斷新冠病毒感染的主要檢測手段是qPCR，然而，qPCR所需的試劑和設(shè)備并不是總是容易獲得，而且樣本通常要運(yùn)送到中央實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行檢測，可能延誤對患者的診斷和治療時(shí)間。為了推進(jìn)對疾病的即時(shí)（point-of-care）診斷，研究人員力圖使用CRISPR編輯技術(shù)開發(fā)簡易、靈敏的分子診斷檢測。張鋒教授團(tuán)隊(duì)在2017年于《科學(xué)》雜志上發(fā)表的基于CRISPR的SHERLOCK技術(shù)。這個(gè)技術(shù)與夏洛克·福爾摩斯同名，為“Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing”技術(shù)的縮寫。從名字上看，它具有特異的高靈敏度。

SHERLOCK的核心是一種叫做Cas13a的蛋白酶和與其結(jié)合的向?qū)NA。根據(jù)新冠病毒的RNA序列，研究人員們精心設(shè)計(jì)了能夠靶向新冠病毒特異性序列的向?qū)NA。理論上講，只要樣本里有新冠病毒所對應(yīng)的RNA，向?qū)NA就能對其進(jìn)行精準(zhǔn)的識別，并激活與其結(jié)合的Cas13a蛋白酶。Cas13a是一種很有趣的酶，一旦被激活，它就會(huì)不分青紅皂白，切開所遇到的任何RNA分子。也正是利用這種特性，研究人員們在樣本里還會(huì)添加一種通過RNA相連接的特殊分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會(huì)被切斷。這樣一來，通過確認(rèn)這些分子有沒有被切斷，我們就能知道最初的樣本里有沒有新冠病毒的存在。

后續(xù)的檢測步驟與市場上的懷孕檢測很相似，將反應(yīng)后的樣本滴在能夠識別“完整分子”和“切斷分子”的試紙上，如果樣本里不存在新冠病毒，那么試紙標(biāo)識“完整分子”的較低位置上，就會(huì)出現(xiàn)一條條帶；相反，如果樣本里真的有新冠病毒對應(yīng)的RNA，那么在代表“切斷分子”的較高位置上，會(huì)出現(xiàn)另一條條帶。通過條帶位置的不同，我們很容易就能確認(rèn)新冠病毒的存在與否。

▲通過條帶的不同位置，我們可以判斷有沒有新冠病毒的存在（圖片來源：參考資料[5]）

張鋒教授和他的合作伙伴在今年2月發(fā)布的新冠病毒檢測技術(shù)就是基于這一原理。隨后，加州舊金山大學(xué)（UCSF）的Charles Chiu教授與Mammoth Biosciences公司的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)，以及阿根廷的布宜諾斯艾利斯大學(xué)和CASPR Biotech的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)也開發(fā)了基于Cas12的新冠病毒CRISPR檢測技術(shù)。然而，這些基于CRISPR的新冠病毒檢測都需要兩個(gè)反應(yīng)步驟，第一個(gè)步驟是使用等溫?cái)U(kuò)增（isothermal amplification）反應(yīng)擴(kuò)增RNA的數(shù)量，然后將擴(kuò)增的樣本加入到包含Cas酶和其它反應(yīng)試劑的試管中進(jìn)行檢測反應(yīng)。這不但增加了檢測流程的復(fù)雜性，而且更多的樣本轉(zhuǎn)移步驟可能帶來的污染。

將等溫?cái)U(kuò)增和Cas酶反應(yīng)合二為一的STOPCovid檢測

因此，張鋒教授和他的合作伙伴致力于開發(fā)一種更為簡便的檢測手段，讓擴(kuò)增RNA數(shù)目的等溫?cái)U(kuò)增步驟和Cas酶檢測的化學(xué)反應(yīng)能夠在同一個(gè)試管中進(jìn)行。為此，他們選擇了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）作為擴(kuò)增RNA的方法。這一選擇也有其實(shí)用方面的原因，因?yàn)長AMP所需的試劑并不難于獲取。

然而LAMP反應(yīng)需要在溫度為60℃的反應(yīng)條件下進(jìn)行，而Cas13a在這一溫度下不夠穩(wěn)定。研究人員找到了名為AapCas12b的Cas酶，能夠在LAMP反應(yīng)條件下維持足夠的活性，同時(shí)對指導(dǎo)RNA和反應(yīng)中的添加劑進(jìn)行了優(yōu)化，讓Cas酶介導(dǎo)的檢測步驟維持足夠的靈敏度。在實(shí)驗(yàn)條件下，這一檢測的下限為100個(gè)新冠病毒RNA分子。

研究人員同時(shí)簡化了提取RNA的步驟，只需要在含有新冠病毒的咽拭子或唾液樣本中加入裂解病毒，釋放RNA的試劑，無需純化分離RNA，就可以將釋放的病毒RNA用于檢測。

▲STOPCovid檢測的測試流程（圖片來源：參考資料[3])

STOPCovid在檢測患者樣本時(shí)表現(xiàn)出100%特異性

在今年2月發(fā)布的研究中，由于患者樣本的稀缺，研究人員只使用合成的RNA對新冠病毒CRISPR檢測的表現(xiàn)進(jìn)行了評估。這次，研究人員使用12個(gè)新冠病毒陽性和5個(gè)新冠病毒陰性患者咽拭子樣本對STOPCovid檢測的特異性和靈敏度進(jìn)行了檢驗(yàn)。每個(gè)樣本都進(jìn)行了三重測試（triplicate）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在5個(gè)新冠病毒陰性的樣本中，STOPCovid沒有給出任何假陽性結(jié)果，而在12個(gè)新冠病毒陽性樣本中，STOPCovid在11個(gè)樣本的三次測試中都給出陽性結(jié)果，在1個(gè)樣本的三次測試中兩次給出陽性結(jié)果。

▲STOPCovid檢測結(jié)果（圖片來源：參考資料[2]）

研究人員表示，他們已經(jīng)準(zhǔn)備了一些初始試劑盒，能夠讓其它的研究人員進(jìn)一步開發(fā)這一檢測平臺。研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)與美國FDA進(jìn)行交流，探索獲得緊急使用授權(quán)（EUA）所需要的步驟。張鋒教授在訪談中表示，這一檢測的獨(dú)特之處在于將化學(xué)反應(yīng)簡化為一個(gè)步驟，從而防治在多步反應(yīng)中因?yàn)檗D(zhuǎn)移液體可能帶來的樣本污染。這使它更適合作為即使檢測使用。

參考資料：

[1] New CRISPR-based test for Covid-19 could be a simple, cheap at-home diagnostic, scientists say. Retrieved May 5, 2020, from https://www.statnews.com/2020/05/05/crispr-covid-19-test-could-be-simple-cheap-at-home-diagnostic/

[2] STOPCOVID. Retrieved May 5, 2020, from https://www.stopcovid.science/

[3] Point-of-care testing for COVID-19 using SHERLOCK diagnostics. Retrieved May 5, 2020, from https://www.stopcovid.science/docs/STOPCovid%20Whitepaper.pdf

[4] Broughton et al., (2020). CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4.

[5] A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Retrieved February 14, 2020, from https://static1.squarespace.com/static/5b7c640be2ccd1703a3da4d3/t/5e46d16cf617da2f796f926e/1581699437272/COVID-19+detection+%28v20200214%29.pdf